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近日，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所使用融智生物QuanSNP核酸質(zhì)譜平臺(tái)建立了肺炎支原體（MP）多位點(diǎn)SNP分型與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（ML）耐藥同時(shí)檢測(cè)的方法。相關(guān)研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)表在iScience上，文章標(biāo)題為“A multisite SNP genotyping and macrolide susceptibility gene method for Mycoplasma pneumoniae based on MALDI-TOF MS”（?https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.102447）。文章的第一作者為趙飛研究員，通訊作者為肖迪研究員，融智生物作為合作單位參與其中。
?肺炎支原體（MP）是引起兒童及成人呼吸道感染的重要病原菌，每年約10%-30%的社區(qū)獲得性肺炎病例由其感染引起。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（ML）是臨床MP感染治療的一線藥物，尤其在兒童中使用非常普遍。2000年以后，國(guó)際上ML耐藥MP比例持續(xù)升高，中國(guó)MP的ML耐藥率一直居高不下。MP的ML耐藥與其23S rRNA基因突變密切相關(guān)，其中2063、2064突變與ML高水平耐藥相關(guān)，2617突變與低水平耐藥相關(guān)。因此，上述位點(diǎn)的基因檢測(cè)成為可替代ML體外藥敏實(shí)驗(yàn)，快速檢測(cè)MP的ML耐藥的技術(shù)。目前耐藥基因檢測(cè)最常用的方法有熒光PCR的高分辨率熔解曲線（HRMA）法、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法和焦磷酸測(cè)序法。
基因分型是MP分子生物學(xué)與流行病學(xué)特征研究的重要手段。MP基因組高度保守，菌株間相似度高達(dá)99%，基于單核苷酸變異和基因插入缺失，肺炎支原體明確分為兩種基因型。基于p1基因的PCR-RFLP分型、基于pl基因的VNTR分型以及基于MPN459/MPNA5864基因的熒光PCR技術(shù)是目前常用的MP基因分型技術(shù)。盡管操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但靶位點(diǎn)單一導(dǎo)致區(qū)分能力有限，是此類方法的劣勢(shì)。多位點(diǎn)的MLVA及MLST分型技術(shù)相繼報(bào)道，有效提升了MP分型能力。然而，上述基因分型技術(shù)耗時(shí)且技術(shù)要求高，使其應(yīng)用受到限制。如果再加上MP耐藥基因檢測(cè)，則MP基本分子生物學(xué)特征檢測(cè)過程更加繁瑣耗時(shí)，因此需要研發(fā)新型快速、低成本的分型與耐藥檢測(cè)技術(shù)。
基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)近年來被用于單位點(diǎn)核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測(cè)。其檢測(cè)原理是，首先使用多重PCR擴(kuò)增含SNP靶位點(diǎn)的目的基因；其次，通過特異性質(zhì)量探針進(jìn)行SNP位點(diǎn)延伸，最后通過MALDI-TOF MS鑒定不同質(zhì)量探針分子量得到檢測(cè)結(jié)果。
基于MALDI-TOF MS的SNP分型分析，在手足口病毒、HBV檢測(cè)以及HPV分型等方向已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并且具有取代傳統(tǒng)鑒定技術(shù)的潛力?；贛ALDI-TOF MS的SNP分析方法具有高通量、快速、多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前最有應(yīng)用前景的生物分子技術(shù)之一。
圖1.?基于MALDI-TOF MS技術(shù)用于MP分型和耐藥基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程圖（左）；
融智生物QuanSNP核酸質(zhì)譜平臺(tái)（右）
在該研究中，開發(fā)了一種基于多重PCR和MALDI-TOF MS方法同時(shí)檢測(cè)MP的6個(gè)分型靶位點(diǎn)和3個(gè)ML耐藥基因。該方法對(duì)20種非MP菌株核酸均未檢測(cè)到質(zhì)量探針延伸信號(hào)，表明該方法具有良好的特異性；肺炎支原體M129菌株用于檢出限測(cè)試，該方法最低檢出限為100拷貝/反應(yīng)。使用141株臨床MP菌株的核酸樣本進(jìn)行分型與耐藥分析，QuanSNP檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序和藥敏結(jié)果一致率100%，表明該方法具有很好的鑒定準(zhǔn)確性。在30例MP陽(yáng)性臨床樣本中，25例中檢測(cè)到9個(gè)分型與耐藥SNP位點(diǎn)，檢測(cè)陽(yáng)性率為83.3%，表明該方法具有良好的臨床標(biāo)本分型和耐藥檢測(cè)能力，適用于MP類生長(zhǎng)緩慢病原體的快速分型與耐藥檢測(cè)。
圖2-A 9個(gè)MPE質(zhì)量探針的質(zhì)譜圖
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?圖2-B?基于肺炎支原體菌株質(zhì)量探針延伸后的質(zhì)譜圖
基于融智生物的QuanSNP核酸質(zhì)譜平臺(tái)，中國(guó)疾控中心傳染病預(yù)防控制所開發(fā)了一種基于多重PCR和MALDI-TOF MS的方法，同時(shí)檢測(cè)MP多位點(diǎn)分型以及ML耐藥基因，該方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、低成本以及高通量的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)MP多位點(diǎn)SNP分型與ML耐藥基因的同時(shí)檢測(cè)，分型能力強(qiáng)且兼顧兩型菌株，耐藥位點(diǎn)檢測(cè)全面且準(zhǔn)確，適用臨床標(biāo)本檢測(cè)。同時(shí)，核酸質(zhì)譜平臺(tái)可滿足客戶的不同檢測(cè)需求，在微生物鑒定、分型以及耐藥檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。
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